English Abstract This report describes the development and performance
characteristics of a HPIC/UV-method for the determination of nitrate and
nitrite in urine, gastric juice, saliva and blood plasma of human origin.
Detection is at 208 nm which ensures adequate selectivity of nitrate and
nitrite versus chloride-, sulphate- and phosphate-ions. Sample preparation
of urine and gastric juice is identical and is done by diluting a test
portion of the sample with water and subsequent chromatographic clean-up
over a SPE column combination consisting of a C18-column coupled in series
with a IC/Ag+ column. The test solution is analysed by HPIC/UV at 208 nm.
For both sample types the nitrite results are only qualitative. Recovery
for nitrate in urine is on average 96% (N=25) for the low spiking level and
on average 103% (N=8) for the high spiking level. For gastric juice the
average recovery results are 98% (N=12) and 101% (N=4) for the low and high
nitrate spiking level respectively. For saliva the sample preparation is
straight forward. The sample, resulting from initial centrifugation, is
diluted with water, centrifugated once more where upon the supernatant is
assayed for nitrite and nitrate content. Nitrite and nitrate both can be
quantified adequately. Average recovery for nitrite spiked at the low level
is 103% (N=12) and for the high level 102% (N=4). For nitrate these figures
are 102% (N=12) for the low and 103% (N=4) for the high spiking level
respectively. Sample preparation of blood plasma proved complicated. For
the deproteization of this type of sample ultrafiltration and precipitation
techniques were tested. In the end, protein precipitation with methanol and
subsequent clean-up of a portion of the supernatant on a C18-IC/Ag+ column
combination proved successful and both analytes were quantified by HPIC/UV
at 208 nm. Results for recovery experiments are adequate with average
values of 100% (N=19) for nitrite and 98% (N=34) for nitrate. For blood
plasma, spiking experiments were carried out at the low enrichment level
only. The procedure resulting of this study is described in SOP nr.
ARO/385.
Rapport in het kort
Dit rapport beschrijft de methode-ontwikkeling en de
prestatiekenmerken van een HPIC/UV-methode voor de bepaling van nitraat en
nitriet in urine, maagsap, speeksel en bloedplasma van humane herkomst.
Gedetecteerd wordt bij 208 nm waardoor voldoende selectiviteit voor nitriet
en nitraat wordt verkregen t.o.v. chloride-, sulfaat- en fosfaat-ionen.
Urine en maagsap worden op identieke wijze voorbewerkt door een deelportie
van het monster te verdunnen met water en vervolgens chromatografisch te
zuiveren over een SPE-kolomopstelling bestaande uit een C18-kolom die in
serie geschakeld is met een IC/Ag+ kolom. De meetoplossing wordt onderzocht
met HPIC/UV bij 208 nm. Nitriet blijkt in beide monstersoorten alleen
kwalitatief te meten. De terugwinning voor nitraat in urine is gemiddeld
96% (N=25) voor het lage niveau van verrijken en gemiddeld 103% (N=8) voor
het hoge verrijkingsniveau. Voor maagsap zijn deze resultaten
respectievelijk gemiddeld 98% (N=12) voor het lage en gemiddeld 101% (N=4)
voor het hoge niveau van verrijken met nitraat. De monstervoorbewerking van
speeksel is eenvoudig. Na certifugeren wordt het monster verdund met water,
nogmaals gecentrifugeerd en het supernatant onderzocht op nitriet- en
nitraatgehalte. Zowel nitriet als nitraat zijn goed kwantificeerbaar. De
terugwinning voor nitriet toevoegingen bedraagt gemiddeld 103% (N=12) voor
het lage en gemiddeld 102% (N=4) voor het hoge niveau van verrijken. Voor
nitraat is de terugwinning gemiddeld 102% (N=12) voor het lage en gemiddeld
103% (N=4) voor het hoge niveau van verrijken. De monster-voorbewerking van
bloedplasma was het moeilijkst. Verschillende manieren zijn onderzocht om
dit monstermateriaal te onteiwitten. Hiervoor zijn ultrafiltratie- en
precipitatie-technieken getest. Uiteindelijk is het gelukt om met methanol
de aanwezige eiwitten neer te slaan en vervolgens, na zuiveren van een
deelportie van het supernatant over een C18-IC/Ag+ kolomopstelling, beide
analyten kwantitatief te bepalen met HPIC/UV bij 208 nm. De resultaten voor
terugwinningsexperimenten zijn goed en bedragen voor nitriet gemiddeld 100%
(N=19) en voor nitraat gemiddeld 98% (N=34). De verrijkingen zijn voor
bloedplasma alleen op het lage niveau van toevoegen uitgevoerd. De
ontwikkelde methode van onderzoek is beschreven in SOP nr.
ARO/385.